人类多能干细胞定向分化为肾脏类器官，为药物筛选、疾病建模和肾脏器官移植带来了希望。目前，这些应用受到类器官变异性、肾单位不成熟、产量低和规模有限等因素的阻碍。为此，澳大利亚默多克儿童研究所的MelissaH.Little课题组在naturematerials发表题为Cellularextrusionbioprintingimproveskidneyorganoidreproducibilityandconformation的论文，研究应用基于挤出三维细胞生物打印来提供快速和高通量的具有高度可重复性的肾脏类器官。

人类多能干细胞(hPSCs)是一种独特的细胞来源，具有重建早期器官形成模型的能力。诱导hPSCs定向分化为人肾祖细胞谱系从而形成三维(3D)肾类器官的方法日趋成熟，增加了从单个起始细胞群重建人肾脏组织的几率。虽然这种差异化方案希望促进药物筛选或组织工程，但需要在扩大规模、质量控制和吞吐量方面有实质性的改进，才能实现这些应用。该团队通过使用基于挤出的3D生物打印技术，来自动化制造在形态、组成细胞类型和基因表达水平上等同于人工生成的自组织肾脏类器官，同时实现了高重复性、高产出率、高分辨率。此外，研究发现改变3D打印构象以改变类器官的生物物理性质可以影响类器官的形态发生，增加肾单位的丰度，上皮结构的构象和成熟度。这促进了更大面积的肾组织贴片的产生，这些肾组织贴片具有更高的肾单位数量并显示出肾单位功能，为组织制造提供了一种潜在的放大解决方案。

该团队使用成熟的肾细胞分化方案，将诱导了7天的hPSCs解离成单细胞悬液，用于产生不含任何载体水凝胶的湿细胞糊剂。然后将其装载到Hamilton注射器中，使用基于NovogenMMX挤压的3D细胞生物打印机进行生物打印(图1a)。随后继续培养0天以允许自发形成肾单位(图1a,b,e)。使用免疫荧光方法来表征肾单位形成（图1c,d）,同时研究表明减少用于产生初始微团的细胞数量，不会损失有机体内的任何组织学复杂性(图1h)。

图17天中胚层细胞糊状挤压细胞生物印迹法制备高重复性iPSC来源的肾脏类器官

肾脏在排除外来物质方面起着至关重要的作用，肾小管特异性溶质通道摄取各种化合物会使肾脏处于肾毒性损伤的风险中。原代肾近端小管上皮细胞因为在二维培养中快速去分化，失去关键转运蛋白和代谢酶的表达，进行临床前肾毒性筛查往往不能准确预测器官特异性毒性。该团队通过生物打印技术产生大量具有低变异系数的高存活率的和可重现的肾脏类器官（图a-c）。通过研究已知的肾毒性药物（阿霉素、阿米卡星、妥布霉素、庆大霉素、新霉素和链霉素）证明生物打印的肾脏类器官可以作为药物肾脏毒性筛选的工具（图d-h）。

图生物打印的肾脏类器官可作为药物筛选的工具

此外，该团队进一步研究了不同类器官构象对组织形态的影响。通过改变细胞挤出速率和尖端移动速度可以精确控制组织厚度。实验通过增加沉积比，从而使线长增加，同时保持每个有机体中起始细胞的绝对数大致相等(1×个细胞)，从而导致细胞质量变薄，分布在更大的表面积上（图3a-e）。通过量化类器官的MAFB（形成的肾小球内的足细胞的特异性标志物，可作为肾单位数量的替代）阳性区域，证明具有细长起始构象的类器官比小而厚的类器官具有更大的mTagBFP阳性肾小球总面积(图3f,g)。除了肾小球数量外，类器官构象的变化也影响了类器官的形态，其中未形成图案的间质组织在类有机物沉积比为0的中心最为明显(图3h)。为了进一步研究这种图案化的转变，该团队通过批量RNA测序(RNAseq)转录图谱分析，与上皮形成和小管形态和功能相关的基因在沉积比40(R40)的类器官中上调（图4a）。对途径变化的基因本体论(GO)分析也表明R40在膜运输、细胞外组织和细胞-细胞粘附都有所改善（图4b）。同时发现当类器官打印成一条线时，肾单位均匀的分布在组织边缘（图4c,d）。

图3利用挤出式生物打印改变类器官构象

图4改变类器官构象可以减少未形成图案的组织，增加肾单位的数量和成熟度

为确定不同构象的类器官是否会影响肾脏类器官的相对细胞组成，通过单细胞RNA测序（ScRNAseq）研究不同沉积比的类器官中的细胞类型组成(图5a)。研究表明所有类器官构象之间的图案非常相似，但在生物打印的线条中（R40）形成的肾单位总数更大（图5b-f）。通过分析每个细胞簇中不同构象之间显著差异表达的基因，发现R40生物打印的类器官中肾单位祖细胞差异基因最多，近端肾小管上皮细胞成熟度提高，肾脏发育基因显著上调（图g-k）。因此在具有相同细胞数量、且构建不同构象不会影响细胞分化的前提下，生物打印显示出更好的肾单位成熟度和更多的肾小球数量。

图5人工生成、生物打印R0和R40的scRNAseq比较

使用干细胞来源的肾组织进行肾脏器官移植是未来生物打印应用的一个方向。人类肾脏含有大约1×个肾单位，而人工生成的肾脏类器官效率低下，以上研究证明通过挤出式生物打印改变了肾脏器官构象，可以实现相同的起始细胞数得到更高的肾单位数。通过生物打印形成一个含有约4×个细胞的、面积约4.8mm×6mm的细胞贴片(图6a-c)。免疫荧光显示细胞贴片具有正确构型的肾单位及白蛋白摄取功能（6d,e）。

图6使用三维挤压细胞生物打印技术生成肾组织贴片

综上所述，研究者使用基于挤出的3D生物打印技术实现自组织肾脏类器官的自动化制造，在形态、成分、细胞组成类型和基因表达水平上与报道的人工生成的肾脏类器官相似，并在此基础上使肾脏类器官具有更低的变异系数、更高的存活率、更可重现性，同时发现改变生物打印构象可以在相同起始细胞数的情况下获取更多的肾单位。本研究为多学科交叉解决肾脏组织工程领域面临的规模和结构方面的挑战提供了新思路。